Разработка и апробация метода биотестирования воды на основе оценки поведения и кардиоактивности брюхоногого моллюска Pomacea sp.

Поведенческие реакции брюхоногих моллюсков в совокупности с их характеристиками кардиоактивности, как показали исследования, могут рассматриваться как перспективные биомаркеры для оценки биологически значимого изменения качества среды их обитания. Функциональное состояние организма используемых в качестве тест-объектов гидробионтов, оцениваемое одновременно по нескольким интегральным характеристикам, дает возможность в значительной мере унифицировать средства и методы биотестирования качества водной среды и определения ее общей токсичности для гидробионтов.

Водные экосистемы, будучи конечным звеном миграции загрязняющих веществ, могут служить индикаторами современной экологической ситуации, складывающейся на примыкающих к ним территориях под воздействием природных и техногенных процессов. Современный экологический подход к определению совокупности признаков, характеризующих качество водной среды, включает оценку ее пригодности для обитания в ней гидробионтов. При этом поведенческие и физиологические характеристики видов-биоиндикаторов могут быть использованы как биомишени для оценки качества, токсичности среды с учетом ее абиотических характеристик.

Биотестирование представляет собой один из приемов исследования в водной токсикологии, который используют для определения степени повреждающего действия химических веществ, потенциально опасных для гидробионтов, в контролируемых экспериментальных лабораторных или полевых условиях путем регистрации изменений биологически значимых показателей (тест-функций) исследуемых тест-объектов, с последующей оценкой их состояния в соответствии с выбранным критерием токсичности. Таким образом, тест-объект выступает в роли «прибора», выявляющего интегральный биологический эффект комплекса неблагоприятных экологических факторов, в том числе и химической природы. Отбор тест-объектов для биотестирования является весьма важным этапом, поскольку, как правило, функциональное состояние животных в природной популяции может быть весьма неоднородным. Это, в свою очередь, может привести к получению, даже на однородной по основным размерно-возрастным и другим (см., например, Зайцева, 1994) характеристикам группе тест-объектов, результатов, которые весьма трудно интерпретировать.

Целью работы являлась разработка и апробация нового физиологического метода оценки токсичности воды с использованием брюхоногих моллюсков в качестве тест-организмов.

Материалы и методы исследования

Объектом настоящего исследования являлся брюхоногий моллюск ампулярия - Pomacea sp., часто используемый в биотестировании пресных вод, например, с помощью методики ПРМ-ТЕСТа (Зайцева, 1997), в которой изменение спектра поведения моллюска используется для оценок токсичности воды. Возраст моллюсков из лабораторной культуры, полученной методом близкородственного скрещивания, был около 6-8 мес. Для оценки адаптационно-компенсаторных возможностей тест-организмов в норме и при токсическом воздействии ионов тяжелого металла (меди) нами применялась методика математического анализа сердечного ритма. Сердечный ритм регистрировался неинвазивно с помощью оригинального волоконно-оптического метода, разработанного в НИЦЭБ РАН (Холодкевич и др., 2007; Kholodkevichetal., 2008).

Длина и гибкость волоконно-оптического кабеля позволяла моллюскам свободно перемещаться по всему аквариуму, не изменяя спектр их естественного поведения.

Для регистрации спектра поведенческих реакций использовался аквариум объемом 3 л (24х12х7,5 см), оборудованный нагревателем воды, аэратором и биофильтром. В одном наблюдении использовали одну улитку. Время каждого наблюдения составляло 1 ч. Время между отсаживанием улитки в экспериментальный аквариум и началом регистрации составляло не менее 15 мин. Все наблюдения проводились в период с 15 до 18 ч дня.

В ходе визуальных наблюдений поведенческих реакций в контрольной среде последовательно регистрировали все четко выраженные поведенческие акты (время активной локомоции, количество остановок, совершенные дыхательные движения (вдохи и выдохи), дефекация, жевательные движения (количество жевательных движений считалось за 1 мин.). Для каждой улитки проводили три повторности. Результаты повторностей затем усреднялись. После проведения трех наблюдений улитку возвращали в аквариум с контрольной водой.

Количественными показателями изменения функционального состояния животного в настоящей работе являлась частота сердечных сокращений. Регистрацию фоновой кардиоактивности улитки проводили непрерывно в течение трех суток в реальном времени. Обработка полученных данных (расчет межимпульсных интервалов, средней ЧСС в выборке из 50 кардиоинтервалов, СКО выборки) осуществлялась программно (Kholodkevichetal., 2007). Регистрацию кардиоактивности улиток проводили одновременно с регистрацией поведенческих актов (Кузнецова и др., 2011 в печати).

В первой серии опытов для каждого моллюска проводили кратковременное (1 час) воздействие 0.25 мг/л медного купороса (50 ПДК Cu2+ для пресных водоемов) путем прибавления в экспериментальный аквариум маточного раствора медного купороса.

Рассматривали кратковременное (1 час) воздействие токсиканта (первая серия опытов) и длительное (5 сут.) воздействие ионов меди на тест-объект. Различия считали достоверными, если вероятность ошибки была меньше 0,05.

Визуально регистрировали поведенческие акты и наличие или отсутствие парадоксальных реакций (парадоксальное дыхание, изменение характера локомоции).

Во второй серии опытов проводили длительное (5 сут.) воздействие токсиканта. После чего повторно регистрировали поведение животного и его кардиоактивность как и в первой серии опытов.

Результаты исследования и их обсуждение

На рис. 2 приведены данные по изменению основных поведенческих реакций моллюсков при 1-часовом воздействии меди.

Измерялись следующие поведенческие биомаркеры: Vлок - средняя скорость передвижения, tакт.лок.- процент локомоций от общего времени наблюдения, Nжев - количество жевательных движений, Nост - количество остановок за время наблюдения, дыхательные акты - вытягивание сифона, «прокачка» кислорода, «пузыри».

Таким образом, в среде с ионами меди животные дольше прибывали в активном состоянии (изменение времени активной локомоции достигало 41±3%), однако это движение за регистрируемый период времени происходило с остановками (количество остановок превышало контрольные на 25±2%). Моллюски в токсической среде начинали быстрее двигаться, скорость локомоции моллюска в токсической среде изменялась на 30±2,3%. Токсикант явно раздражал слизистую губ моллюска, в результате чего количество жевательных движений увеличивалось на 28±1,5%.

Для каждого животного выявляли характерные изменения фотоплетизмограммы, отражающей сокращения сердца животного, при совершении улиткой определенных поведенческих актов в норме и при действии токсической среды. Значение показателя фиксировалось на всем протяжении совершения поведенческого акта, во время каждого наблюдения. Затем вычислялось среднее значение по каждому показателю для каждого поведенческого акта, среди трех наблюдений в контрольной воде по каждому из семи животных.

По показателю кардиоактивности при кратковременном воздействии меди выявлено значимое изменение (средней ЧСС, уд/мин) для всех экспериментальных животных (рис. 3-6). Как было отмечено выше, количество жевательных движений - скребковые движения радулой, которые совершает моллюск в токсической среде, увеличивалось, при этом наблюдали и повышение ЧСС.

Необходимо отметить, что у моллюсков, выращенных в условиях лаборатории и полученных путем близкородственного скрещивания, регистрировали весьма близкие значения фоновых ЧСС и небольшой разброс значений в индивидуальных реакциях моллюсков, т.е. вся выборка животных достаточно однотипно отвечала на воздействие.

При стрессовом воздействии (хэндлинг), когда животное брали руками, оставляя его при этом в контрольной нормальной воде, наблюдали активные движения обеих пар щупалец, в то время как в токсической среде животное внешне не реагировало на воздействие.

Возрастание ЧСС при остром воздействии больших концентраций тяжелых металлов, например, в нашем случае ионов меди, является компонентом физиологического механизма детоксикации тяжелых металлов (ТМ), который включает усиление процессов фильтрации в перикардии. При действии ТМ тахикардия способствует усилению фильтрации гемолимфы в полости сердечной сумки, адсорбции ТМ в почечном эпителии и их последующее выведение из организма. Сигналом к запуску кардиорегуляторных возбуждающих нейронов центральной нервной системы моллюска скорее всего служит изменение сенсорной импульсации, поступающей с различных периферических рецепторов, в т.ч. и специализированного хемосенсорного органа осфрадия.

При хроническом воздействии меди (пять суток) наблюдалось общее снижение двигательной активности и переход на защитно-оборонительное поведение с явными признаками патологического процесса. Из актов такого поведения отмечено, что вся двигательная активность у животного замедлена. Движение улитки по горизонтальной поверхности совершается неравномерно, улитка как бы «спотыкается», наблюдаются внешне неспровоцированные резкие подергивания частей тела. Втягивание моллюска в раковину происходит медленнее, либо вовсе остается незавершенным. В этом случае часть мягких тканей остается снаружи раковины. Акты как питания, в случае, когда животным предлагали еду, так и дефекации, у моллюска отсутствовали.

Среди дыхательных актов отмечено увеличение незавершенных (сифон не полностью вытянут и не достигает границы вода-воздух, не отмечено прокачивающих движений), т.е. парадоксальных дыхательных актов. Анализ изменения ЧСС моллюска при таком воздействии выявил увеличение вариабельности кардиоритма с чередованием в кардиоритме участков временной тахикардии, сменяющейся брадикардией.

Выводы

Таким образом, на примере моллюска Pomacea sp. в настоящем исследовании показано, что поведенческие реакции брюхоногих моллюсков в совокупности с их характеристиками кардиоактивности, могут рассматриваться как перспективные биомаркеры для оценки биологически значимого изменения их среды обитания. Проводимые работы могут быть основанием для дальнейшего физико-химического исследования природной среды с целью идентификации интенсивности загрязнения, осуществления экологической экспертизы состояния природных и сточных вод и предотвращения загрязнения среды, опасного для биоты и человека.

Литература:
1. Строганов Н.С. Методика определения токсичности водной среды. В сб. Методика биологических исследований по водной токсикологии. - М.: Наука. 1971. С. 14-61.
2. Крайнюкова А.Н., Ульянова Н.П., Лысенко И.Е. Токсикологический контроль и нормирование сброса сточных вод на основе биотестирования // Экологические, технические и организационные основы охраны вод. Харьков. 1986. С. 147-151.
3. Методические указания по установлению эколого-рыбохозяйственных нормативов (ПДК и ОБУВ) загрязняющих веществ для воды водных объектов, имеющих рыбохозяйственное значение // Ред. Филенко О.Ф., Соколовой С.А. - М.: ВНИРО, 1998. 145 С.
4. Оганесова Е.В., Филенко О.Ф. Действие токсичных веществ на брюхоногих моллюсков Planorbis corneus в хроническом опыте// Материалы IV Всероссийской конференции по водной экотоксикологии, посвященной памяти Б.А.Флерова
«Антропогенное влияние на водные организмы и экосистемы». 24-29 сентября 2011г. Борок. 2011. Часть 1. С. 177-181.
5. Зайцева О.В. Экспресс-способ биотестирования пресных вод «Поведенческие реакции моллюсков» («ПРМ-ТЕСТ») // Бюлл. изобретений. 1997. № 17. Патент № 2082167. МПК: G01N33/18.
6. Зайцева О.В., Виноградов А.Е. Биологический способ определения степени общей токсичности и основных токсикантов водной среды (варианты) // Бюл. изобр. 1998. N 12. Патент N 2110067. МПК: G01N33/18.
7. Методические рекомендации по применению методов биотестирования для оценки качества воды в системах хозяйственно-питьевого водоснабжения. МР № ЦОС ПВ Р 005-95. М., 1995.
8. Куриленко В.В., Зайцева О.В. Экспресс-оценка токсичности вод на основе биотестирования (на примере поверхностных водоемов Санкт-Петербурга) // Водные Ресурсы. 2005. Т. 32, № 4. С. 425-434.
9. Kholodkevich S.V., Fedotov V.P., Ivanov A.V., Kuznetsova T.V., Kurakin A.S., Kornienko
E.L. Fiber-optic remote biosensor systems for permanent biological monitoring of the surface waters quality and bottom sediments in the real time http://www.ices.dk/products/ CMdocs/CM-2007/I/I-2007.pdf. 15 р.
10. Холодкевич С. В., Иванов А. В., Корниенко Е. Л., Куракин А. С. Способ биологического мониторинга окружающей среды (варианты) и система для его осуществления // Бюл. Изобретений, 2007, №29. Патент РФ № 2308720 C1, МПК G01N 33/18 (2006.01); G01N 21/17 (2006.01).
11. Зайцева О.В., Ковалев В.В., Шувалова Н.Е. Современное биотестирование вод, требования к тест-организмам и тест-функциям с позиций сравнительной физиологии и физиологии адаптационных процессов // Журн. эволюц. биохим. и физиол. 1994. Т. 30, N 4. С. 575-592.

Журнал «Вода Magazine», №2 (54), 2012 г.