Некоторые методические подходы к изучению ферментативной активности в водной среде в связи с качеством воды

УДК 574.5

Качество воды в водных экосистемах зависит от ряда природных факторов и процессов. Среди них существенную роль играют экзоферменты. В МГУ разработана новая методика выявления и характеристики активности экзоферментов в воде, в которой используется измерение поляризации флуоресценции белков, меченных флуоресцеинизотиоцианатом (FITC). Эта методика позволяет измерять протеолитическую активность экзоферментов в водной среде. С использованием этого подхода протеолитическая активность была впервые обнаружена в природных образцах воды (с природным сообществом планктона) из пресноводной экосистемы Московской области. Протеолитическая активность была обнаружена в образце воды до и после удаления планктона (фитопланктона и бактериопланктона). Удаление планктона из водной среды осуществляли путем фильтрации воды.

Ключевые слова: качество воды, протеолитическая активность, ферментативная активность, экзоферменты, новые методы, пресноводные экосистемы, фитопланктон, бактериопланктон, фильтрация воды.

Качество воды в водоемах и водотоках зависит от комплекса природных процессов, которые были описаны, систематизированы и проанализированы в теории самоочищения воды, сформулированной в публикациях. В этой теории определенное место отводится внеклеточной ферментативной активности в водной среде (экзоферментам, exoen- zymes) [10, 11].

Некоторая информация об экзоферментах в воде водоемов имеется в научной литературе, но необходимо дальнейшее накопление фактов в этой области.

Цель данной публикации - изложить результаты разработки некоторых методических подходов для изучения ферментативной активности в водной среде природного происхождения или в аналогичных образцах водной среды, в которой выращивали фитопланктон (в образцах воды из природных водоемов или культур клеток фитопланктона).

Планктонные организмы активно потребляют растворенные органические соединения. Для изучения этих процессов в основном используют меченые по 14С или 3Н низкомолекулярные соединения, такие как глюкоза, аминокислоты, гидролизат водорослей и др. Однако в водоемах основная масса органического вещества представлена высокомолекулярными соединениями. Потребление их требует предварительного гидролиза экзоферментами.

Ферментативные процессы в водной среде являются важными при изучении многих явлений в жизни водных экосистем, а именно при изучении: утилизации организмами растворенного органического вещества (РОВ), очистительной способности водоемов и формирования качества воды, трансформации органического вещества по трофической цепи и др.

С целью получить больше информации для более полного понимания механизмов этих явлений были проведены эксперименты по изучению протеолитической активности водо- рослей и бактерий в природных водоемах и лабораторных экспериментах.

Материал и методика исследований

Протеолитическую активность (proteoliticactivity) определяли методом, основанным на измерении поляризации флуоресценции меченого флуоресцентным красителем флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ) (fluoresceinisothiocyanate, FITC) белка-иммуноглобулина G (IgG-ФИТЦ) под воздействием ферментов-протеаз, выделяемых в среду микроорганизмами [5, 7]. Данный метод обладает высокой чувствительностью и позволяет определять экзопротеазную активность всего за несколько минут без концентрирования пробы. Он применяется при изучении кинетики ферментативных процессов, некоторых вопросов фармакологии и биохимии [1, 5, 9].

Схема проведения эксперимента по изучению протеолитической активности имеет следующий вид. В анализируемую пробу (в воду из водоема или лабораторной культуры организмов) добавляют трассер (меченый флуоресцентным красителем белок) и анализируют степень его деградации под действием присутствующих в воде ферментов. Интенсивность броуновского движения молекул зависит, в частности, от размера молекул. Если молекула содержит флуоресцентную метку, то поляризация флуоресценции служит мерой броуновского движения и дает информацию о размерах макромолекул. Под действием ферментов происходит их гидролиз, это, в свою очередь, сказывается на величине молекулы, а соответственно и поляризации флуоресценции. Таким образом, по величине поляризации флуоресценции судят об относительном изменении размеров макромолекул в процессе ферментативной реакции.

В качестве метки используется флуоресцентный краситель - флуоресцеин. Последний при возбуждении испускает флуоресцентный свет, степень поляризации которого зависит от скорости его вращения. Метка в свободном состоянии вращается быстро; между периодом поглощения и испускания света молекула равновероятно принимает любую ориентацию, что приводит к полной деполяризации сигнала. Таким образом, в водном растворе поляризация флуоресцеина приближается к нулю. Если же метка связана с крупными молекулами (в частности, с белками), то ее вращение замедляется, и величина поляризации возрастает. Таким образом, чем крупнее молекула, тем выше величина поляризации. Под действием ферментов происходит гидролиз пептидных связей в молекуле белка, в результате чего размеры молекул уменьшаются и это сказывается на величине поляризации флуоресценции.

Регистрация поляризации флуоресценции осуществляется на специальном приборе (TDX-анализатор, фирма ABBOTT Laboratories, США), который позволяет измерять поляризацию флуоресценции, а микропроцессор выдает распечатку результатов с учетом калибровочных кривых. Время, необходимое для получения окончательных результатов, составляет 5 минут. Прибор позволяет одновременно анализировать до 20 проб объемом 1 мл. Этот метод можно использовать и для изучения активности иных литических ферментов.

В исследованиях в качестве субстрата использовали иммуноглобулин человека (IgG), меченый флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ). В эксперименте (к примеру, в сообщество водорослей и бактерий) добавляли IgG-ФИТЦ (концентрация 1,25 мкг/мл), который при наличии фермента-протеазы гидролизовался. Пробы с IgG-ФИТЦ инкубировали в течение 3 часов (анализ проводили каждый час).

Таким образом, в ходе эксперимента измерялась величина поляризации флуоресценции IgG-ФИТЦ в процессе его деградации под действием протеаз. В качестве контроля использовали стерильный буфер (не содержащий протеаз), чтобы иметь исходный уровень отсчета флуоресценции молекул IgG-ФИТЦ.

Единицы измерения протеолитической активности таким методом - усл. единицы/час. Достоинство этого метода - более высокая оперативность, чем у некоторых других методов измерения протеолитической активности.

Описанным выше методом можно изучать скорость протеолитической реакции как в культурах, так и в природных водоемах.

Схема проведения экспериментов с образцами природной воды (из водоема) была следующей:
1. В образце природной воды (условное название - образец 1) измеряли протеолитическую активность. Часть образца подвергали фильтрации с целью удаления относительно крупных клеток фитопланктона.
2. Полученный после отфильтровывания фитопланктона образец воды, не содержащей фитопланктон (условное название - образец 2), брали для определения протеолитической активности. Часть этого образца подвергали дополнительной фильтрации с целью удаления из него бактерий.
3. Полученный после второй фильтрации образец воды, лишенный и фитопланктона, и бактериопланктона (условное название - образец 3, или условно «чистая» вода) брали для определения протеолитической активности.

Протеолитическую активность в образце 1 брали за 100%. Отношение протеолитической активности в образце 3 к таковой в образце 1 давало возможность выразить в процентах ту долю протеолитической активности, которая наблюдалась в воде, лишенной планктона (и фитопланктона, и бактериопланктона). Эта доля в процентах количественно характеризовала наличие в водной среде экзоферментов, находящихся в свободном состоянии в воде.

Результаты исследований

Известно, что через клеточную стенку микроорганизмов проникают лишь низкомолекулярные соединения. В связи с этим высокомолекулярные соединения должны быть предварительно гидролизованы экзоферментами. В гетерогенных системах (почвах, илах, на поверхности детрита и др.) выделенный в среду фермент локализован в непосредственной близости от клетки, а продукты гидролиза сразу же потребляются этими организмами [3, 4, 8]. В толще воды (в гомогенной системе) наблюдается иная картина: ферменты, выделенные в среду, поступают в общую копилку РОВ (растворенного органического вещества) водоема. Продукты гидролиза потребляются всей биотой (в первую очередь бактериями и водорослями) независимо от того, могут они или не могут экскретировать в среду литические ферменты. Несмотря на неодинаковую способность организмов экскретировать в среду литические ферменты, многие из них (а это бактерии, водоросли, грибы, простейшие и даже некоторые многоклеточные) способны потреблять низкомолекулярные соединения, что и было показано многими исследователями. А скорость потребления РОВ организмами во многом зависит от их физиологических возможностей, концентрации органического вещества в среде, ряда биотических и абиотических факторов.

Потребление органического вещества бактериям и водорослями вызывает резонный вопрос о способности этих групп микроорганизмов выделять в среду экзоферменты и взаимосвязи этих процессов с их гетеротрофной активностью. Чтобы ответить на некоторые из этих вопросов, был проведен ряд экспериментов с природным фито- и бактериопланктоном.

В работе анализировали потребление водорослями и бактериями низко- и высокомолекулярных соединений (на примере аминокислоты и белка) с одновременным анализом в среде протеолитической активности с использованием метода поляризации флуоресценции.

Исследования с природным сообществом фитопланктона и бактериопланктона показали, что в воде присутствуют протеазы, которые гидролизуют белок до его составляющих (аминокислот). Последние в дальнейшем потребляются как водорослями, так и бактериями.

Эксперименты и измерения ферментативной активности в различных образцах водной среды показали следующее.

Наличие ферментативных процессов (протеолитической активности) было выявлено в образцах водной среды трех типов:
- в водной среде природного сообщества планктона, куда входил фитопланктон и бактериопланктон;
- в водной среде, которая содержала только бактерии (после отфильтровывания из этих образцов водорослей);

- в водной среде, которую условно можно назвать «чистая вода», т.е. во- да, не содержащая бактерий и водо- рослей (после отфильтровывания из этой среды бактерий и водорослей).

Способность «чистой» воды к ферментативному гидролизу белка указывает на наличие экзоферментов (экзопротеаз) в свободном состоянии. В проведенных экспериментах на долю этого фильтрата (т.е. «чистой» воды) приходилось в среднем 76% от ферментативной активности природного сообщества фитопланктона и бактериопланктона (за 100% принята ферментативная активность в водной среде с природным сообществом фитопланктонаи бактериопланктона).

Выявление ферментативной активности в водной среде из природной пресноводной экосистемы дополнительно подчеркивает важность и необходимость изучения вопросов
на стыке экологии и биохимии [12, 13]. Новые результаты подтверждают выводы, сделанные в книге [14], о важности и большой роли процессов, осуществляемых экзоферментами в водных экосистемах. Получено еще одно свидетельство продуктивности сформулированной одним из авторов статьи новой концепции трансформации веществ в водных экосистемах, которая в публикации [14], была названа «экзометаболизмом».

Дальнейшее изучение этих вопросов поможет лучше понять комплекс природных процессов, которые ведут к формированию и поддержанию качества воды [10, 11, 14, 15], что имеет большое практическое значение для устойчивого использования источников водоснабжения.

Выводы:
1. Разработаны методики изучения протеолитической активности в образцах воды природного происхождения из конкретного пресноводного водоема Московской области.
2. Выявлена протеолитическая активность в водной среде природного сообщества планктона, в которое входит бактериопланктон и фитопланктон.
3. Выявлена протеолитическая активность в водной среде, из которой были отфильтрованы и удалены клетки и бактерий, и фитопланктона.
4. Полученные результаты имеют значение для изучения и понимания природных экологических факторов и процессов, которые формируют качество воды в водных экосистемах.

Авторы благодарят аспирантов, стажеров и дипломников, которые участвовали в работах по изучению пресноводных экосистем.

Литература:
1. Бекбергенов Б.М., Житников В.Г. Иммуноанализ на основе прямого измерения поляризации флуоресценции при изучении фармакокинетики антибиотиков. // Антибиотики и химиотерапия. 1988, т. 33. № 1, с. 72-76.

2. Дмитровский Л.Г., Садчиков А.П. Стимуляция протеолитической активности бактерий некоторыми водорослями. // Гидробиологический журнал, 1994, т. 30, № 1, с. 53-59.
3. Звягинцев Д.Г. Почвы и микроорганизмы. - М.: изд-во Московского ун-та, 1987, 256 с.
4. Купревич В.Ф., Щербакова Т.А. Почвенная энзимология. - Минск, Наука и техника, 1966, 275 с.
5. Савицкий А.П. Флуоресцентный анализ: иммуноанализ, гибридные ДНК, биосенсоры. // Успехи биологической химии, 1990, т. 31, с. 209-240.
6. Садчиков А.П., Френкель О.А., Скобеева Т.Н. Ферментативная и гетеротрофная активность водорослей и бактерий. // Гидробиологический журнал, 1992, т. 28, № 6, с. 51-55.
7. Садчиков А.П., Френкель О.А., Дмитровский Л.Г., Еремин С.А. Ферментативная и гетеротрофная активность водорослей и бактерий при потреблении меченых аминокислот, дипептида и белков. // Гидробиологический журнал, 1993, т. 29, № 3, с. 71-76.
8. Хазиев Ф.К. Ферментативная активность почв. - М.: Наука, 191976, 173 с.
9. Юденфренд С. Флуоресцентный анализ в химии и медицине. // М.: Мир, 1965, 484 с. 10. Остроумов С.А. О биотическом самоочищении водных экосистем. Элементы теории // Доклады академии наук (ДАН). 2004. т.396. № 1. с.136-141. https://www. researchgate.net/publication/265294672;
11. Остроумов С.А. О некоторых вопросах поддержания качества воды и ее самоочищения. // Водные ресурсы. 2005. т.32. № 3. с. 337-347.
12. Остроумов С.А. Введение в биохимическую экологию. М. Изд-во МГУ. 1986. 176 с. https://www.researchgate.net/publication/ 292699681.
13. Ostroumov S.A. On the concepts of biochemical ecology and hydrobiology: Ecological chemomediators // Contemporary Problems of Ecology. 2008, V.1, p.238-244. https://www. researchgate.net/publication/201999918.
14. Остроумов С.А. Гидробионты в самоочищении вод и биогенной миграции элементов. Москва, МАКС-Пресс. 2008, 200 с. https://www.researchgate.net/publication/ 266200066.
15. Садчиков А.П., Котелевцев С.В., Остроумов С.А. Количественные исследования детрита в водной среде пресноводных экосистем в связи с вопросами качества воды // Вода Magazine, 2017, № 7.

On methodical approaches to studying enzymatic activity in aquatic environment in connection with water quality

Water quality in aquatic ecosystems depends on a number of natural factors and processes. Among them, a sub- stantial role is played by exoenzymes. In this paper, new methods to discover and characterize activity of exoenzymes in water were developed. The new methodology uses measurement of polarization of fluorescence of proteins labeled with fluoresceinisothiocyanate, (FITC). This methodology allows measurement of proteolitic activity of exoenzymes in aquatic environment. Using this approach, proteolitic activity was discovered in natural samples of water (with the natural community of plankton) from a natural freshwater ecosystem in the Moscow region of Russia. Proteolitic activ- ity was discovered in the water sample before and after removal of phytoplankton and bacterioplankton by water fil- tration.

Keywords: water quality, proteolitic activity, enzymatic activity, exoenzymes, new methods, freshwater ecosystems, phytoplankton, bac- terioplankton, water filtration.

Sadchikov Anatoly Pavlovich, doctor of biology, professor, International biotechnological center, e-mail: Адрес электронной почты защищен от спам-ботов. Для просмотра адреса в вашем браузере должен быть включен Javascript.;

Ostroumov Sergey Andreevich, doctor of biology, leading researcher of the laboratory of physico-chemistry of biomembranes.

Moscow state University named after M. V. Lomonosov. Russia, 119234, Moscow, Leninskie Gory, 1, bld. 12, faculty of biology, Moscow state University.

Журнал «Вода Magazine», №8 (120), 2017 г.