Сравнение эффективности 3M Petrifilm Salmonella Express System с классическими методами определения сальмонелл в воде на модельных суспензиях и природных образцах

УДК 579.6+001.891.53+658.562

Статья посвящена оценке возможности применения тест-системы 3M™ Petrifilm™ Salmonella Express System (SALX) для определения сальмонелл в рамках санитарно-микробиологического контроля вод различного типа. При исследовании модельных суспензий тестовых микроорганизмов тест-система SALX продемонстрировала удовлетворительные результаты, хотя был выделен только один из двух модельных штаммов сальмонелл. На пробах природной воды SALX оказалась неэффективной. Ее чувствительность существенно уступала классическому методу исследования, прежде всего из-за высокой ингибирующей активности самих подложек 3M™ Petrifilm™ Salmonella Express (SALX) Plate. Дифференцирующие свойства подложек также существенно уступали классическим средам из-за малого размера колоний, скудности дифференцирующих признаков и возможности их искажения типичных для сальмонелл признаков при обильном постороннем росте. Необходимость дальнейшей классической идентификации подозрительных колоний и необходимость 24 часового селективного обогащения вместо заявленного 8 часового сводит на нет преимущества 3M™ Petrifilm™ Salmonella Express System (SALX) в скорости проведения анализа.

Ключевые слова: сальмонеллы, анализ воды, производственный контроль, экспресс-методы.

В настоящей статье мы продолжаем рассказывать о собственном опыте использования в санитарно-бактериологическом анализе воды продукции американской компании 3М под общей торговой маркой Petrifilm®, кторая все шире завоевывает российский рынок расходных материалов и оборудования для санитарной микробиологии, особенно в сфере контроля пищевых продуктов и сырья. Тест-системы Petrifilm® представляют собой сухие питательные среды на специальных пластиковых подложках. Такие тест-системы являются одним из перспективных решений, упрощающих процедуру бактериологического анализа. Срок хранения сред на подложках не уступает сроку хранения сухих сред, а способ применения заметно проще, так как исключаются этапы приготовления, стерилизации и разливки, нет необходимости в подготовке посуды, а инокуляция пробы, в большинстве случаев, не требует сложных манипуляций. На рынке питательных сред представлен широкий ассортимент подобной продукции. В настоящей работе мы представляем результаты апробации пригодности тест-системы 3M™ Petrifilm™ Salmonella Express System для использования в санитарно-микробиологическом исследовании различных типов вод и сравнения ее эффективности с классическим методом.

До сих пор бактериологический метод исследования остается «золотым стандартом» санитарной микробиологии. В отличие от молекулярно-биологических и иммунологических методов исследования бактериологический метод позволяет оценить жизнеспособность исследуемых групп микроорганизмов, а его чувствительность на порядок превышает чувствительность других методов, однако в классическом виде он уже мало соответствует реалиям современной жизни, прежде всего, из-за своей трудоемкости и длительности.

Согласно ИСО 19250:2010(R) «Качество воды. Выявление бактерий рода Salmonella spp.» [3], методика определения сальмонелл в воде является сложным, многостадийным процессом. Минимальное время получения отрицательного ответа составит около 4 суток, а при наличии типичных колоний, подозрительных на принадлежность к роду Salmonella, получение окончательного положительного ответа возможно в среднем через 6-7 суток. Не следует также забывать о трудоемкости метода, которая связана, прежде всего, с приготовлением целого ряда питательных сред, их хранением и утилизацией.

Новая тест-система 3M™ Petrifilm™ Salmonella Express System (SALX), предназначенная для ускоренного определения сальмонелл бактериологическим методом, была анонсирована в 2013 году и стала продолжением экспансии продуктов 3M™ Petrifilm™ на рынке средств микробиологического контроля.

Salmonella Express System (SALX) позиционируется, прежде всего, как тест-система для контроля пищевых продуктов, однако производитель заявляет о ее пригодности и для исследования смывов с поверхностей различных объектов [4]. Данная тест-система соединяет в себе элементы классического метода с преимуществами питательных сред на подложках и подразумевает два алгоритма исследования для слабо и сильно контаминированных образцов (рис. 1). Сильно контаминированными считаются образцы, уровень КМАФАнМ в которых превышает 104 КОЕ/г(мл).

Первичное обогащение подготовленного образца осуществляется в фирменной среде обогащения - 3M Salmonella Enrichment Base, в которую перед использованием добавляется специальная селективная добавка - 3M Salmonella Enrichment Supplement. Образцы инкубируют 18 часов при 41,5°C. Далее обогащенные образцы с низкой степенью контаминации высевают петлей на заранее подготовленные подложки 3M™ Petrifilm™ Salmonella Express (SALX) Plate для получения изолированных колоний (рис.2). Посевы инкубируют 24 ± 2 часа при 41,5°C.

При исследовании образцов с высокой степенью фоновой контаминации обогащенный образец перед высевом на подложку подвергают дополнительному этапу селективного обогащения в среде Раппопорт-Вассилиадис в течение 8 часов при 41,5°С.

После инкубации посевы на подложках просматривают на предмет наличия типичных колоний: красных колоний, ассоциированных с зоной пожелтения вокруг колонии, красных колоний, ассоциированных с пузырьками газа либо красных колоний, обладающих обоими признаками (рис. 3).

При отсутствии типичных колоний выдается отрицательный результат, время получения которого составит для малоконтаминированных образцов 38-44 часа, а для высококонтамини рованных - 48-52 часа, что в два раза быстрее по сравнению с классическим методом (таблица 1).

При наличии типичных колоний их отмечают маркером на пленке, покрывающей питательную среду на подложке, и проводят их биохимическую идентификацию путем наложения на посев специального диска 3M™ Petrifilm™ Salmonella Express (SALX) Confirmation Disk, покрывающего всю площадь посева. Подложку вместе с диском инкубируют 4 часа при 41,5°C. Сальмонеллами будут считаться бактерии, образующие типичные колонии, которые при инкубации с диском меняют свой цвет с красного на черно-синий.

Таким образом, использование 3M™ Petrifilm™ Salmonella Express System (SALX) позволяет получить биохимически подтвержденный положительный результат уже через 42-56 часов, что в три раза быстрее по сравнению с классическим методом (таблица 1).

Материалы и методы

Апробация тест-системы выполнялась в несколько этапов. На первом этапе мы оценивали эффективность 3M™ Petrifilm™ Salmonella Express System (SALX) серии КА2014-11 на модельных суспензиях эталонных культур. Для работы использовали четыре штамма из рабочей коллекции эталонных культур ЗАО «РОСА». Штаммы и состав модельных суспензий представлены в таблице 2.

Две порции по 100 мл стерильной деионизованной воды заражали двумя вариантами смесей целевых и не целевых штаммов и фильтровали через мембранные фильтры (МФ) 0,45 мкм Millipore серии F3NA63463. МФ со сконцентрированными образцами помещали в 100 мл среды обогащения SALX с селективной добавкой и инкубировали 18-20 часов при (42±1,0)°С. Далее по 0,1 мл каждой обогащенной смеси пересевали в 10 мл среды Rappoport-Vassiliadis R10 broth (далее RVS) серии 2248306, согласно инструкции по исследованию высококонтаминированных проб. Инкубировали 24 часа при (42±1,0)°С. После первичного обогащения, а также после 8 и 24 часов вторичного обогащения в RVS из каждого образца модельной смеси делали высевы параллельно на подготовленные подложки SALX и на классические среды XLT4-agar (далее XLT4) серии vm512719 311 и висмут-сульфитный агар (далее ВСА) серии 209172. Идентификацию типичных колоний выполняли методом SALX при помощи идентификационного диска SALX (серии КА 2015-03) и классическим методом, включая серотипирование. Параллельно такие же модельные смеси исследовались классическим методом согласно [3].

На втором этапе мы оценивали эффективность 3M™ Petrifilm™ Salmonella Express System (SALX) на пробах природных и сточных вод. 2 л проб природных вод и 100 мл проб сточных вод концентрировали на достаточном количестве МФ Millipore 0,45 мкм серии F3NA63463, которые помещали в 100 мл среды обогащения SALX. Дальнейшее исследование проводили по схеме, описанной выше для модельных образцов, с тем отличием, что высев после первичного обогащения не проводился. Параллельно такой же объем пробы исследовался классическим методом согласно [3]. В качестве среды неселективного обогащения использовалась забуференная пептонная вода (далее БПВ) серии vm432928 228, а в качестве второй среды селективного обогащения Selenite Cystine Broth (далее SCB) серии vm546609 328. Схема опыта отражена на рис. 4.

Полученные результаты

При апробации 3M™ Petrifilm™ Salmonella Express System (SALX) на модельных суспензиях в посевах обеих смесей после первичного обогащения на подложках SALX обнаружены типичные колонии сальмонелл, соответствующие описанию производителя (точечные, красно-кориченевые с желтым ореолом), которые после биохимической идентификации при помощи диска SALX подтвердились как сальмонеллы.

В посевах модельной смеси №1 признаки постороннего роста не обнаруживались ни на подложках SALX, ни на высевах со среды обогащения SALX на классические среды, ни при классическом исследовании.

В посевах смеси №2 признаки постороннего роста наблюдались только при высеве со среды обогащения SALX на XLT4. При этом колонии нецелевых штаммов не составляли проблемы для дальнейшей идентификации.

При исследовании классическим методом посторонний рост также наблюдался в комбинациях с XLT4, но он стал проблемой только в комбин ции SCB - XLT4. Для дальнейшей идентификации были доступны только 2 колонии.

Из каждого варианта посева смеси №2 после 24 часового обогащения на RVS и из посевов классическим методом мы сняли по 3-6 типичных колоний для дальнейшей биохимической и серологической идентификации. Результаты представлены в таблице 3.

Результаты оценки эффективности 3M™ Petrifilm™ Salmonella Express System (SALX) на пробах природных и сточных вод представлены в таблице 4. Цветом обозначены ячейки с полжительным результатом, а цифра в ячейке отражает количество серотипов сальмонелл, идентифицированных в пробе. Всего было исследовано 8 проб сточной воды и 5 проб природной. Классическим методом сальмонеллы были обнаружены в 6 пробах сточной и 1 пробе природной воды, тогда как методом SALX только в 1 пробе сточной воды после 8 часового вторичного обогащения и в 3 пробах после 24 часового обогащения в RVS.

Обсуждение результатов

При исследовании модельных суспензий целевых и нецелевых штаммов в соотношении 1:10000 тест-система 3M™ Petrifilm™ Salmonella Express System (SALX) показала неплохие результаты и соответствовала параметрам, заявленным производителем. Однако классическим методом из посева модельных смесей были выделены оба внесенные штамма сальмонелл, тогда как методом SALX только один - S.abony. Это свидетельствует о неодинаково благоприятных условиях сред SALX для разных серотипов сальмонелл.

В отличие от исследования модельных суспензий эталонных культур при исследовании проб реальных водных объектов тест-стстема 3M™ Petrifilm™ Salmonella Express System (SALX) продемонстрировала крайне низкую чувствительность и специфичность. Если методом ИСО сальмонеллы были обнаружены в 7 пробах из 13, то при использовании тест-системы SALX после 8 часов обогащения сальмонеллы были обнаружены только в одной пробе, а после 24 часов обогащения только в трех образцах из 13. Кроме того, система SALX также уступала и по количеству выделенных серотипов сальмонелл в положительных пробах (таблица 4).

Становится очевидным, что при исследовании проб природной и сточной воды 8 часового обогащения в среде RVS недостаточно и требуется полноценное обогащение 24 часа, что на сутки удлиняет заявленное производителем время анализа. Но даже при этом чувствительность системы SALX остается низкой и существенно уступает классическому методу.

Основная причина низкой чувствительности системы SALX, на наш взгляд, кроется в избыточной ингибирующей активности на целевые штаммы самих подложек Petrifilm® SALX. Этот тезис подтверждают результаты параллельного высева из системы обогащения SALX на традиционные среды, которые представлены в таблице 5.

При высеве на традиционные среды эффективность метода оказалась сравнима с методом ИСО, однако при этом терялись преимущества, которые дают сухие подложки Petrifilm®.

Второй по важности причиной, на наш взгляд, является отсутствие этапа неселективного обогащения, значимость которого мы уже демонстрировали в своих предыдущих работах [1, 2]. Отдельно хочется остановиться на одном из самых слабых мест тест-системы 3M™ Petrifilm™ Salmonella Express System (SALX), на ее дифференцирующих свойствах, которые существенно уступают классическим средам (рис. 5).

Колонии, вырастающие на подложках, очень мелкие, а типичные колонии от нетипичных отличает только наличие желтого ореола или пузырьков газа (рис. 3). В ряде случаев типичные колонии легко различимы, но при большом скоплении нетипичной флоры или сильном газообразовании дифференцирующие признаки колоний искажаются и их невозможно достоверно определить. Как следствие, для надежной идентификации подозрительных и сомнительных колоний требуется получение субкультур подозрительных клонов с последующей биохимической и серологической идентификацией классическим способом, а не способом, который используется в системе SALX. Следовательно, при отсутствии типичных колоний время анализа удлиняется, так как идентификация будет занимать столько же времени, сколько и в классическом методе.

Выводы:

Подложки SALX обладают всеми традиционными для подложек Petrifilm™ преимуществами перед классическими и готовыми средами:
- простотой приготовления и использования;
- компактностью при хранении, инкубации и утилизации;
- длительными сроками хранения.
Дифференцирующие свойства подложек Petrifilm™ SALX очень низкие и уступают классическим средам:
- из-за скудности дифференцирующих признаков;
- из-за микроскопического размера колоний;
- из-за возможного искажения свойств колоний.

При исследованиях проб воды 8 -часового селективного обогащения недостаточно.

Низкая эффективность тест-системы Petrifilm™ Salmonella Express System, обусловлена, прежде всего, высокой ингибирующей активностью подложек Petrifilm™ SALX.

На основании этого можно сделать вывод о том, что использование тест-систем Petrifilm™ Salmonella Express System может ускорить выполнение анализа по определению сальмонелл, как заявлено производителем, при условии преобладания сальмонелл в обогащенной смеси над нецелевыми микроорганизмами. Однако, учитывая низкую чувствительность системы и низкие дифференцирующие свойства, мы считаем ее малопригодной для санитарно-микробиологического контроля воды.

Литература:
1. Ахапкина Е.Н., Тымчук С.Н. Методические аспекты выделения сальмонелл из воды // Питьевая вода. 2006. № 1. С. 19 - 23.
2. Ахапкина Е.Н., Тымчук С.Н., Устинова С.Н., Спиридонова Е.Ю., Дородников А.И., Ларин В.Е. Выделение сальмонелл из воды // VI Международный конгресс ЭКВАТЭК- 2004 «Вода: экология и технология». Матери алы конгресса. Часть II. 1 - 4 июня 2004 года. С. 828 - 829.
3. ИСО 19250:2010(R) «Качество воды. Выявление бактерий рода Salmonella spp.»
4. Erin Crowley, Megan Boyle, Patrick Bird, et al, Comparative Evaluation of the 3M™ Petriflm™ Salmonella Express System for the Detection of Salmonella species in Food and Environmental Surfaces, Q Laboratories, Inc., 1400 Harrison Avenue, Cincinnati, OH 45214, March 12, 2013.

Efficiency comparison of 3M Petrifilm Salmonella Express System classical methods for the determination of Salmonella in water, on model suspensions and natural samples

The article is devoted to the assessment of the feasibility of the test system 3M™ Petrifilm™ Salmonella Express System (SALX) for the determination of Salmonella within the sanitary/microbiological control of waters of different type. In the study of model suspensions of test microorganisms test system SALX has demonstrated satisfactory results, although it was allocated only one of the two model Salmonella strains.
The analysis of samples natural water by test/SALX system was ineffective. Its sensitivity was significantly less than ones of the classical method of cultivation, primarily due to the high inhibiting activity themselves substrates 3M™ Petrifilm™ Salmonella Express (SALX) Plate. The differentiating properties of the substrate, is also substantial/ ly inferior to the classic cultivation methods, because of the small size of the colonies, the scarcity of differentiating features and their possible distortions typical Salmonella signs with copious extraneous growth.
The necessity for further identification of suspect colonies and the necessity for 24 hour selective enrichment instead of the 8 hour claimed, negates the advantages of the 3M™ Petrifilm™ Salmonella Express System (SALX) in the speed of analysis.

Keywords: salmonella, water analysis, production control, rapid methods.

Tymchuk Sergey Nikolaevich, candidate of medical Sciences, senior bacteriologist CJSC «ROSA». e<mail: Адрес электронной почты защищен от спам-ботов. Для просмотра адреса в вашем браузере должен быть включен Javascript.

Larin Vladimir Evgenyevich, candidate of biological Sciences, head of Department of biological methods of analysis, JSC «ROSA».

Akhapkina Elena Nikolaevna, chief of bacteriology and Virology CJSC «ROSA».

Spiridonova Ekaterina Yurievna, bacteriologist CJSC «ROSA».

Seleznev Alexander Sergeevich, PhD, associate Professor of the First MGMU them. I. M. Sechenov. 119048, Moscow, St. Trubetskaya, 8.

Журнал «Вода Magazine», №12 (100), 2015 г.