Минеральный состав шунгитовой воды и ее воздействие in vitro на клетки нанобактерий

Как показали проведенные исследования шунгитовой воды и результаты анализов на масс-спектрометре, в воду, находившуюся в контакте со щебнем шунгита, наряду с макро- и микроэлементами экстрагируются и редкоземельные ультрамикроэлементы - лантаноиды. Феномен воздействия шунгитовой воды на кальцинированные микроорганизмы - нанобактерии обусловлен агрегированием клеток с нарушением их структуры, сопровождающимся появлением «пустых» капсул или оболочек клеток, что вероятнее всего связано с физико- химическими свойствами лантаноидов.

Известно, что вода как раствори- тель и носитель минеральных элементов является ключевым ингредиентом, влияющим на здоровье человека и животных. В организме человека обнаруживают до 70 химических элементов, существующих в природе, при этом 47 из них постоянно присутствуют, имея в живом организме свою определенную функцию. Совершенно очевидно, что изменение физиологически обоснованной концентрации любого из элементов чреваты различными отрицательными последствиями.

Главная характеристика раствора - это его качественный и количественный состав, который принято выражать через концентрацию растворенного вещества. Естественное протекание различных процессов в растворе определяется его активностью, характеризующей способность вступать в различного рода взаимодействия. Вокруг шунгита и шунгитовой воды имеется много различных толкований и домыслов. Учитывая массовость различных рекомендаций по применению шунгитовой воды с акцентированием внимания на ее бактерицидные свойства, простоту и доступность ее получения, возникает необходимость более детального изучения минерального состава шунгитовой воды с проверкой способности воздействия на биологические объекты.

Целью данной работы являлся контроль минерального состава шунгитовой воды при различных условиях подготовки и времени контакта шунгита с экстрагентом - водой с последующей проверкой влияния шунгитовой воды на клетки микроорганизмов - нанобактерии.

Материалы и методы

Для исследований использовали покупной камень - природный шунгит в виде щебня, изготовленный в соответствии с ТУ 5714-007-12862296-01 «Дробленые и молотые шунгиты Зажогинского месторождения». Отправной точкой исследований послужила сопроводительная инструкция изготовителя по использованию камня, из содержания которой следует, что горная порода - шунгит не токсична, экологически безопасна, не требует утилизации. Химический состав шунгита приведен в таблице 1.

В соответствии с рекомендациями перед использованием щебень шунгита необходимо промыть в проточной воде от шунгитовой пыли. Затем щебень массой 1 кг поместить в стеклянную или эмалированную посуду и прокипятить в течение 15-20 мин. в трех литрах воды.

Предварительная подготовка шунгита к использованию была выполнена в двух вариантах. По первому варианту 100 г навески щебня шунгита последовательно промывали в водопроводной, дистиллированной и бидистиллированной воде. По второму варианту 100 г шунгитового щебня промывали в проточной воде и затем кипятили 15 мин. в дистиллированной воде. В качестве экстрагента использовали бидистиллированную воду, которую заливали по 0,5 л в отдельные стеклянные флаконы и вносили подготовленные навески шунгита. Последовательно через 42 и 120 час. экстрагирования отбирали образцы шунгитовой воды по 100 мл и помещали на +4°С.

Контроль минерального состава шунгитовой и контрольной воды проводили методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой (ICP-MS) на приборе Elan DRCII (PerkinElmer SCIEX Instruments, USA). Исследуемый водный раствор с помощью перистальтического насоса подается в распылитель, в котором потоком аргона превращается в аэрозоль. Через центральный канал плазменной горелки аэрозоль попадает в плазму, где под воздействием высокой температуры (7000 - 8000 К) вещества, содержащиеся в пробе, диссоциируют на атомы, которые затем ионизируются. Образовавшиеся положительно заряженные ионы проходят через систему ионной оптики в анализатор, где происходит фильтрация ионов по массе и детектирование ионного потока.

Помимо исследований водных экстрактов по содержанию химических элементов методом масс-спектрометрии проверяли также биологическую активность шунгитовой воды при ее воздействии на клетки нанобактерий, новых микроорганизмов, представителей наномира [2, 6, 8, 9, 10].

Для проверки биологического воздействия шунгитовой воды на микроорганизмы из крови человека и животных выделяли клетки нанобактерий методом дифференциального центрифугирования. Для этого цельную кровь разводили буферным раствором в соотношении 1:10, замораживали при температуре жидкого азота (-196°С) для разрушения эритроцитов.

Для отделения фрагментов разрушенных в процессе гемолиза клеток проводили первое центрифугирование в пробирках типа Эппендорф объемом 1,5 мл на настольной лабораторной центрифуге типа ОПн-8УХЛ4.2 при 3000 об/мин в течение 15 мин. На втором этапе осветленную надосадочную жидкость переносили в чистые пробирки типа Эппендорф, а образовавшиеся осадки утилизировали. Для отделения клеток нанобактерий проводили повторное центрифугирование при 7000 об/мин в течение 30 мин. После этого надосадочную жидкость с помощью пипетки удаляли, а осадок в виде бляшки в каждой пробирке ресуспендировали в шунгитовой воде. Контрольные образцы получали путем ресуспендирования осадка в буферном растворе и в бидистиллированной воде.

Воздействие шунгитовой воды на клетки нанобактерий оценивали в сравнительных опытах методом электронной микроскопии. Препараты для электронной микроскопии готовили по методике негативного контрастирования с использованием 4% раствора фосфорно-вольфрамовой кислоты рН 6,8. Детально методика получения клеток нанобактерий и их исследований изложена в монографии А.П. Пономарева [7]. Собственно электронную микроскопию проводили на электронном микроскопе JEM-100CX (Япония) при инструментальном увеличении 10000-40000.

Результаты исследований

 Образцы шунгитовой воды и контрольный образец воды, взятой в качестве экстрагента, исследовали методом масс-спектрометрии на наличие минеральных составляющих. На основании анализа была получена качественная и количественная характеристика водных растворов по химическим элементам. В процессе контактирования твердой и жидкой фаз экстрагировалось от 53 до 63 химических элементов в различных концентрациях, которые мы классифицировали в соответствии с рекомендациями, представленными в работе А.В. Бгатова [1]. Различия по качественному составу шунгитовой воды возможно объясняются непостоянством химического состава твердой фазы в виде щебня из различных партий шунгита. Из анализа общего количества химических элементов следует, что 13-15 наименований имели нулевые показатели (ванадий, галлий, ниобий, индий, цирконий, теллур, гафний, тантал, висмут и др.).

Данные по общему минеральному составу для конкретного типового опыта показали, что при подготовке щебня шунгита путем его промывки в проточной воде с последующей экстракцией в течение 42 и 120 час. выход элементов значительно выше и соответственно равен 24,8 и 60,2 мг/л, а после кипячения - 12,0 и 21,0 мг/л. Из опытов следует, что предварительное кипячение уменьшает экстракцию химических элементов в 2-3 раза по сравнению с простой промывкой, то есть на этапе кипячения происходит интенсивная диффузия части химических элементов. При контроле воды по водородному показателю установлено, что в шунгитовой воде отмечается снижение рН до 3,3-3,5 от значения рН 7,5 в контрольном образце.

В таблице 2 приведены данные по содержанию в шунгитовой воде наиболее распространенных в живой природе химических элементов, которые формируют группу макроэлементов.

Из таблицы 2 следует, что между промывкой и кипячением камней перед заливкой их бидистиллированной водой существенные различия по выходу макроэлементов натрия, калия и кальция отсутствуют. Усредненные данные по содержанию магния свидетельствуют о большем выходе данного элемента из промытых камней по сравнению с кипяченными, соответственно - 10,2 и 5,15 мг/л. А по выходу кремния картина обратная - 0,65 и 1,43 мг/л.

В таблице 3 приведены экспериментальные данные, характеризующие экстракцию из щебня шунгита жизненно важных микроэлементов. Опыт показал, что наиболее высокий выход микроэлементов получен после промывки щебня. Например, увеличение времени экспозиции в 2,8 раза дает прирост содержания железа в 2,6 раза.

По выходу условно эссенциальных элементов отмечено присутствие так называемой «узко специализированной группы элементов»: литий 1-2 х 102 мг/л; никель из просто промытых камней - 1,5 и 3,6 мг/л и кипяченных - 0,4 и 1,0 мг/л; кадмий - 1-3 х 10-2 мг/л и свинец 1 х 10-3 мг/л.

Из группы нейтральных абиогенных элементов при увеличении времени экстрагирования с 42 до 120 часов отмечается интенсивный выход алюминия из промытых камней соответственно - 5,8 и 13,5 мг/л и гораздо меньший выход после обработки камней кипячением - 0,4 и 2,2 мг/л. Выход рубидия независимо от режима подготовки составляет 1 х 10-3 мг/л и титана -2-6 х 10-3 мг/л.

К главным особенностям шунгитовой воды относится то, что в ее минеральный состав включено семейство редкоземельных элементов, которые сходны между собой по химическим свойствам и физическому строению. В таблице 4 приведены данные по содержанию лантаноидов в экстрагенте - шунгитовой воде. В контрольном образце отмечается полное отсутствие лантаноидов.

Из таблицы 4 следует, что экстракция редкоземельных элементов характеризуется повышенными концентрациями в среднем на один порядок при идентичном времени экстрагирования из промытых камней по сравнению с камнями после кипячения.

К особенностям редкоземельных элементов относится то, что они всегда присутствуют вместе, что и следует из данных таблицы 4. Относительно свойств лантаноидов известно, что они с рядом органических структур образуют комплексные соединения. Кроме того, биологическое действие лантаноидов связывают с их способностью замещать Са+2 в биологических системах. Они действуют как антиметаболиты Са2+, вытесняя его из систем с одним или более белковыми факторами коагуляции [5].

Определившись с тем, что наиболее высокий выход химических элементов отмечается при подготовке камней шунгита обычной промывкой против кипячения, были проведены исследования по выходу минеральных элементов в зависимости от массы шунгита. Установлено, что оптимальное соотношение экстрагент/шунгит составляет 200 г щебня на 1 литр воды. По размеру щебень должен проходить через горлышко стеклянных лабораторных флаконов. Использование порошка шунгита при получении шунгитовой воды не показало существенного отличия в выходе минеральных элементов. Наоборот, чем крупнее щебень, тем эффективнее происходит экстракция химичес- ких элементов. Относительно сведе- ний о присутствии фуллерена в соста- ве шунгита и его бактерицидных свойствах следует отметить, что в на- ших опытах для экстрагирования фул- лерена в качестве экстрагента мы использовали бромбензол с последую- щим анализом методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Для проверки биологического воздействия in vitro на микроорганизмы из крови человека и животных выделяли клетки нанобактерий, которые отдельно суспендировали в буферном растворе, бидистиллированной воде и в экстрагенте - шунгитовой воде с экспозицией в течение суток при температуре +4°С. Выбор температуры обусловлен необходимостью уменьшения воздействия теплового фактора. Результаты воздействия оценивали по изменению морфологии клеток нанобактерий и по их количеству в контрольном и опытных образцах. Документирование проводили методом электронной микроскопии с получением электронных микрофотографий. На рис. 1 приведены изображения клеток нанобактерий из крови кролика и крови человека.

Вегетативные формы клеток нанобактерий представляют собой палочко- и нитевидные структуры с признаками бинарного деления. Данные структуры по размерному критерию нами отнесены к нанобактериям: палочковидные при диаметре 40-50 нм имеют длину 100-150 нм. У нитевидных клеток длина может достигать до 1 мкм при диаметре 40-50 нм. Второй разновидностью бесполого размножения клеток нанобактерий является почкование, когда от материнской клетки диаметром 300-500 нм отпочковываются дочерние элементарные тельца диаметром 50-60 нм (стрелки, рис. 1а) [8]. При суспендировании в бидистиллированной воде морфология клеток не изменяется по сравнению с буферным раствором (рис. 1б). Трансформированные клетки, присутствующие в популяции, имеют форму близкую к сферической и часто увеличены в размерах. Морфологически данные структуры напоминают «пустые» белковые капсулы (стрелки, рис.1б).

Следствием суспендирования клеток нанобактерий в экстрагентах шунгита с экспозицией в течение 18- 24 час. явилось образование скоплений или агрегатов из большого числа клеток (рис. 2.). Кроме того, отмечено воздействие на их структуру, обусловленное образованием «пустых» капсул, то есть отмечается разрушение интактных структур.

Возможной причиной образования агрегированных комплексов является то, что пребывание клеток в среде с кислым значением рН 3,3-3,5 сопровождается их перезарядкой. Клетки приобретают положительный знак заряда и образуют крупные комплексы. Вторым наиболее вероятным фактором, объясняющим образование агрегатов клеток и появлением «пустых» капсид, является наличие в экстрагенте редкоземельных элементов, для которых известна их способность к образованию комплексов с органическими соединениями. Нарушение структуры клеток нанобактерий, которые содержат в своем составе кальций, также следует связать с действием лантаноидов, обладающих способностью замещать Са+2 в биологических системах [3, 4].

Заключение

Из результатов проведенных исследований следует, что процесс экстрагирования из твердого природного материала - шунгита сопровождается образованием биологически активного водного раствора рН 3,3- 4,0, содержащего не только макро- и микроэлементы, но ультрамикроэлементы - лантаноиды. Эффект воздействия in vitro на микроорганизмы - клетки нанобактерий обусловлен физико-химическими свойствами лантаноидов - их способностью к комплексобразованию и замещению кальция в биологических системах.

Литература:
1. Бгатов А.В. Биогенная классификация химических элементов // Философия науки, 1999, №2 (6) http://www.water.ru/digest/biogen_classification.shtml.
2. Вайнштейн М.Б., Кудряшова Е.Б. О наннобактериях // Микробиология. - 2000. - Т. 69. - № 2. - С. 163-174.
3. Влияние нанобактерий на качество и безопасность питьевой воды / Е.В. Гарасько, Р. Р. Шиляев, А.П. Пономарев, А.П. Горшенин // Вестн. Иванов. мед. акад. - 2011. - Т. 16. - № 2. - С. 14-19.
4. Горшенин А.П., Гарасько Е.В., Пономарев А.П. Кальцинирующие наночастицы в питьевой воде // Водоснабжение и санитарная техника. - 2010. - № 12. - С. 20-24.
5. Грошева В. И. Особенности комплексообразования тетрациклина с ионами редкоземельных металлов: дис. ... канд. физ.-мат. наук : 03.00.02 Москва, 2006. - 127 с.
6. Нанобактерии (перспективы исследований) / В.Т. Волков, Г.В. Смирнов, М.А. Медведев, Н.Н. Волкова. - Томск: Твердыня, 2003. - 359 с.
7. Пономарев А.П. Электронная микроскопия нанобактерий и других представителей микро- и наномира.(монография) - ИП Журавлева. - Владимир, 2011. - 180 с.
8. Пономарев А.П., Гарасько Е.В. Морфологические изменения в структуре нанобактерий под воздействием некоторых физико-химических факторов // Нанотехнологии: наука и производство - 2011. - № 1 (10). С. 27-34.
9. Ciftciogly N. Nanobacteria-discovery of a new form of life // Horizons. - 2006. -Vol. 31. - P. 7-8.
10. Folk R.L. Nanobacteria // J. The University of Texas at Austin USA. - 1998. - Vol. 8. - P. 462-467.

Журнал «Вода Magazine», №1(53), 2012 г.