Обоснование возможности использования новых наноструктурированных материалов для очистки воды в системах питьевого и хозяйственно-питьевого водоснабжения

В ходе исследований, проведенных с целью оценки эффективности очистки воды и изменения ее качественных показателей при использовании в водоподготовке новых наноструктурированных материалов на основе оксида титана, наибольшую антимикробную активность проявил образец материала на медной сетке при условии его фотокаталитической активации видимым светом. Доказанный фотокаталитический эффект антибактериального воздействия позволил рекомендовать данный образец для использования при конструировании опытных устройств очистки питьевых и сточных вод, контаминированных микробиотой смешанной таксономической принадлежности, с целью контроля и предотвращения распространения бактериальных инфекций с водным путем передачи.

По сравнению с известными микроструктурированными материалами для очистки воды наноструктурированные материалы имеют ряд преимуществ, в том числе большую активную площадь. Использование наноструктурированных материалов создает благоприятные предпосылки для эффективного решения задач по очистке воды от органических загрязнителей и микроорганизмов [15]. Наиболее часто с целью фотокаталитической очистки применяются соединения диоксида титана. При контакте со светом на его поверхности образуются радикалы кислорода, которые убивают до 99,9% бактерий и вирусов.
Разработчики утверждают, что при контакте с обработанной поверхностью погибают даже такие агрессивные возбудители, как вирусы атипичной пневмонии и птичьего гриппа. Известны аналогичные покрытия на основе оксидов других тугоплавких металлов.

В Белорусском государственном университете информатики и радиоэлектроники созданы опытные образцы наноструктурированных оксидов титана. В ходе научно-исследовательской работы, выполняемой в РУП «Научнопрактический центр гигиены» в рамках задания 3.2.04 государственной программы научных исследований «Междисциплинарные научные исследования, новые зарождающиеся технологии как основа устойчивого инновационного развития» (ГПНИ «Конвергенция») в 2012-2014 гг. проведены исследования с целью оценки эффективности очистки воды и изменения ее качественных показателей при использовании в водоподготовке вышеуказанных новых наноструктурированных фотокаталитически активных материалов на основе оксида титана (далее - НСМ) и разработки рекомендаций по их использованию в хозяйственно-питьевом водоснабжении [67].

Материалы и методы

Объектами исследования стали четыре опытных образца новых НСМ на основе диоксида титана (TiO 2 ), разработанных УО «Белорусский государственный университет информатики и радиоэлектроники». Экспериментальные образцы отличались способами получения и природой подложки: образец №1 - диоксид титана на титановой фольге; образец №2 -диоксид титана на алюминиевой фольге (три слоя); образец №3 - диоксид титана на медной сетке; образец №4 - диоксид титана на стеклянной подложке.

Проанализированы подходы к оценке эффективности очистки и изменения качественных характеристик воды при использовании наноструктурированных фотокаталитически активных материалов (НСМ) по данным научной литературы и технических нормативных правовых актов, включая международные подходы и подходы отдельных стран, на основании проведенного анализа разработана схема проведения экспериментальных исследований опытных образцов НСМ.

В модельном эксперименте изучались потенциальные дезинфицирующие свойства опытных образцов НСМ в отношении грамотрицательной и грамположительной микрофлоры, их эффективность в отношении органического загрязнения по индикаторному показателю «перманганатная окисляемость», оценена методом биотестирования интегральной токсичности питьевой воды после экспонирования образцами наноматериалов.
Эксперименты выполнялись в соответствии с принципами наилучшей лабораторной практики с использованием стандартизованных методов исследований. Исследования проводились в условиях фотоактивации НСМ видимым светом и без фотоактивации. Для моделирования экспериментов с фотоактивацией использовали светодиодную лампу типа Model 01200100011 с характеристиками EL-PL10PW, 50 Гц, 10 Ватт, тип G23D, color - purm white.
Высота расположения источника видимого света от суспензии составляла 9,5 см. Рабочая поверхность образцов составляла 3,5х3,5 см 2.

Дизайн экспериментальных исследований по оценке изменений физико-химических параметров и микробного загрязнения исходных и получаемых в результате водоподготовки вод в модельных условиях включал несколько этапов:
1. Разработка и обоснование условий проведения эксперимента - экспериментальный подбор тестовых концентраций, времени экспозиции, высоты расположения источника света.
2. Экспериментальные исследования по изучению эффективности образцов в отношении микробного и химического загрязнения воды в модельном эксперименте с фотоактивацией и без фотоактивации с длительностью экспозиции, установленной на первом этапе.
3. Оценка методом биотестирования интегральной токсичности питьевой воды после ее экспонирования образцами наноматериалов, проявившими максимальный эффект.

Для изучения антимикробной активности НСМ нами были разработаны методические подходы, позволяющие получать воспроизводимые результаты опытов, а также обоснованы параметры оценки эффективности дезинфицирующего воздействия НСМ. Предложено в качестве тест-культур использовать музейные штаммы бактерий. При этом действие целесообразно изучать на суточных культурах, полученных как в жидких питательных средах, так и на поверхности агаризованных питательных сред при оптимальных режимах культивирования тест-штамма.

В качестве тест-моделей для оценки антимикробного действия использовали музейные штаммы Escherichia coli АТСС 8739 и Staphylococcusaureus АТСС 25923, полученные из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов. Музейные штаммы микроорганизмов обладали типичными морфологическими, культуральными и физиолого-биохимическими признаками соответствующих таксономических групп бактерий, а также хорошими ростовыми свойствами. Проведенные на предыдущих этапах исследования показали, что действие НСМ целесообразно изучать на суточных культурах, полученных как в жидких питательных средах, так и на поверхности агаризованных питательных сред при оптимальных режимах культивирования тест-штамма.

E.coli АТСС 8739 выращивали на скошенном мясопепетонном агаре в течение 18 часов, смывали стерильным физиологическим раствором и готовили ряд разведений по оптическому стандарту мутности Фарланда до рабочей концентрации клеток 104 -106 КОЕ/мл.

Применяли следующие питательные среды: среда Эндо (НПО «Питательные среды, Россия), мясопептонный агар и физиологический раствор (производства НПО «Диалек», РБ). Среды готовили и автоклавировали согласно рекомендациям производителя.

В первой серии эксперимента оптимизировали параметры проведения оценки биологического действия испытуемых НСМ на тест-модель E.coli АТСС 8739. Оптимизированы такие параметры, как: плотность клеточной суспензии рабочей культуры, объем инокулята при проведении культивирования после воздействия, способ посева при проведении культивирования. Достоверные результаты были получены при плотности рабочей культуры E.coli АТСС 8739 102 - 10 4 КОЕ/мл.

Во второй серии эксперимента изучали непосредственно антимикробную активность НСМ в отношении грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов.

Известными методами оценки антибактериальной активности наноматериалов являются методы определения активности водной взвеси коммерческих наночастиц. Нами был предложен подход к тестированию НСМ, основанный на изучении наночастиц, нанесенных на поддерживающий слой (нанопластинки). Таким образом, моделировались условия, максимально близкие к используемым в технических решениях устройств водоподготовки. Ингибирующее действие образцов НСМ на основе TiO2 на рост тестмоделей изучали в условиях прямого контакта образцов с суспензией микроорганизмов.

Тестируемые образцы НСМ разме ром 3,5х3,5 см2 помещали в стерильный стеклянный лабораторный стакан объемом 100 мл, содержащий 50 мл бактериальной суспензии (тестмодель). Затем бактериальную суспензию экспонировали видимым светом в течение двух часов. В качестве источника видимого света использовали светодиодную лампу типа Model 01200100011 с характеристиками EL PL-10PW, 50 Гц, 10 Ватт, тип G23D, color - purm white. Высота расположения источника видимого света от суспен зии составляла 9,5 см.

Тесты в отношении каждой тест-модели включали:
- тест 1: бактериальная суспензия + наноматериалы с фотоактивацией видимым светом;
- тест 2: бактериальная суспензия + наноматериалы без фотоактивации видимым светом;
- контроль 1: бактериальная суспензия + облучение видимым светом;
- контроль 2: бактериальная суспензия без облучения видимым светом.

Антимикробный эффект оценивался через 0, 15, 30, 60, 90, 120 мин. экспозиции.

Оценку численности микроорганизмов после воздействия осуществляли методом посева 1 мл суспензии на поверхность дифференциально диагностических питательных сред: Эндо для E. coli АТСС 8739, желточно-солевого агара - для S. aureus АТСС 25923. Посевы культивировали при оптимальной температуре 35-37°С в течение 18 - 24 час.

Все эксперименты проводили в трех повторностях. Результаты учитывались по количеству выросших колоний микроорганизмов с последующим пересчетом колониеобразующих единиц на 1 мл (КОЕ/мл).

Изучение антибактериальной активности проводили в ходе нескольких серий экспериментов с различной степенью бактериальной нагрузки: начальная плотность культур составляла 102 - 106 КОЕ/мл (2,57-5,61 Lg).

Изучение эффективности образцов наноматериалов в отношении органического загрязнения воды проводили по обобщенному показателю «перман ганатная окисляемость». Пластинку с рабочей поверхностью площадью 3,5х3,5 см 2 , покрытую с одной стороны исследуемым материалом, погружали в 125 мл модельного раствора (смесь речной воды и дистиллированной воды в соотношении 1:1), закрывали чашкой Петри и выдерживали при комнатной температуре в течение 30 мин., 1 часа, 2 часов, 3 часов на рассеянном свету с воздействием лампой видимого света и без воздействия. Величину перманганатной окисляемости модельных растворов определяли согласно [8]. Исходная величина перманганатной окисляемости модельных растворов составляла 2,5 и 2,7 мг/л для первого и второго циклов эксперимента соответственно.

Оценка интегральной токсичности питьевой воды после экспонирования образцами наноматериалов проводилась методом биотестирования в соответствии с основным принципом практического лабораторного биотестирования на батарее чувствительных биотестов из тестобъектов, представляющих основные трофические уровни водной экосистемы. Батарея тестов разработана в Республиканском научно-практическом центре гигиены и состоит из ракообразных (D.magnа, C.vidua и H.incongruens) и водорослей Сhlorella vulgaris (стандартной методикой и методикой с применением флуориметра «ФОТОН 10»). Для проведения исследований использовали музейные штаммы из коллекции РУП «НПЦГ»: синхронизированные одновозрастные лабораторные культуры ракообразных D.magna ЦГ1, С.vidua ЦГ2, H.incongruens ЦГ3 и лабораторные культуры водорослей Chlorella vulgaris и Chlorella spp. из ра бочей коллекции ГНУ «Институт биофизики и клеточной инженерии НАН Беларуси». Использовались стандартизованные методики исследований и методики, разработанные в РНПЦ гигиены в рамках НИР [912].

Эксперименты проводили в двух повторностях, при этом в водопроводную питьевую воду погружали образцы нанопластин, проявившие максимальный эффект, и выдерживали их в течение 30 минут, одного часа, двух часов, трех часов с воздействием лампой видимого света и без воздействия; высота источника от образца составляла 9,5 см. Полученные образ цы воды тестировали на острую интегральную токсичность.

Результаты и их обсуждение

Выбор в качестве тест-моделей Escherichia coli и Staphylococcus aureus обусловлен тем, что оба микроорганизма являются санитарно-значимыми, при этом E.coli является палочковидной грамотрицательной бактерией, а S.aureus – представитель кокковой. Кишечная палочка проявляет самую низкую чувствительность среди энтеробактерий к негативным воздействиям внешней среды, а потому считается наиболее релевантной тест-моделью для оценки санитарно-эпидемиологической безопасности.

Разработанные методические подходы позволили получать воспроизводимые результаты и оценивать параметры эффективности воздействия нанопластинок на референс-штаммы микроорганизмов. В качестве критерия количественной оценки ингибирующего действия обоснован показатель редукции R, рассчитываемый по формуле:
R = Lg0-Lgn , где
Lg0 - десятичный логарифм численности популяции до воздействия, Lgn - десятичный логарифм численности популяции после nмин воздействия.

Результаты экспериментов по оценке антимикробных свойств опытных НСМ, нанесенных на различные подложки, при начальной плотности бактериальной суспензии 5,62, 5,22 - 5,61 Lg представлены  на рис. 1.

Выявлено, что наибольший антимикробный эффект проявляли образцы диоксида титана TiO2 , нанесенные на медную сетку (рис. 2-4).

При этом ингибирующий эффект был значительно более выражен, если образцы НСМ активировали видимым светом. Так, при малой загрузке (2,61 Lg) фактор редукции для активированных НСМ в течение 15 мин. Экспозиции составил 1,1 Lg для E.coli и 1,3 Lg – для S. aureus. Экспозиция в течение 30 мин. и более приводила к полному подавлению роста E.coli, 90 мин. и более - к полному подавлению роста S. aureus. Изменения численности микроорганизмов в результате воздействия были достоверными при уровне значимости р<0,05.

Следует отметить, что эффект ингибирования был более выражен при использовании менее значительной микробной нагрузки, составлявшей < 3 Lg.
В работе было показано также, что воздействие образцов структурированных наноматериалов приводит не только к ингибированию роста популяции тест-штаммов, но и к изменению фенотипических свойств, характерных для данного вида микроорганизмов. Так, штамм E.coli АТСС 8739 изменял свои тинкториальные свойства, что приводило к вариабельности окраски по Граму. Изменялась также типичная форма вегетативных клеток и уменьшался их размер.

Полученные результаты свидетельствуют, что штамм E.coli АТСС 8739 более чувствителен к воздействию образцов НСМ на основе диоксида титана TiO 2 , фотоактивированных видимым светом, чем штамм S.aureus АТСС 25923, что подтверждают экспериментальные данные ряда авторов о том, что TiO2 в условиях фотоактивации может ингибировать рост и развитие грамотрицательных и грамположительных бактерий, хотя грамположительные бактерии менее чувствительны из-за их способности образовывать споры. По нашему мнению, выявленный эффект может быть обусловлен различиями в строении клеточной стенки бактерий, приводящими к разным механизмам взаимодействия с наноструктурами.

Механизм антимикробной активности НСМ на основе TiO2 связывают с продукцией активных форм кислорода, которые нарушают целостность цитоплазматической мембраны и разрушают клеточную стенку микроорганизмов.

Исследования структурно-функциональных изменений вегетативных и споровых клеток бактерий показали, что их гибель при воздействии наноструктурированных образцов TiO2 наступает в том случае, когда разрушается клеточная стенка, обнажается цитоплазматическая мембрана и наступают нарушения ее основной функции барьера проницаемости, влекущие за собой выход из клетки жизненно важных растворимых компонентов. Однако четкого и согласованного представления о механизме деструктивного воздействия НСМ на основе TiO2 на микроорганизмы нет, что связано с множественностью воздействующих факторов, трудностью интерпретации полученных результатов [6, 7].

Заключение

Полученные результаты позволили сделать следующие выводы:
1. В качестве тест-культур для оценки дезинфицирующего действия НСМ целесообразно использовать музейные штаммы грамотрицательных бактерий E.coli и граммположительных S. aureus.
2. Разработанные методические подходы по оценке антимикробной активности позволяют получать воспроизводимые результаты, а также оценивать параметры эффективности воздействия НСМ на референс-штаммы микроорганизмов в условиях модельного эксперимента, при оценке в качестве критерия оценки ингибирую щего воздействия рекомендуется использовать фактор редукции.
3. Наибольшую антимикробную активность проявил образец НСМ TiO2 на медной сетке при условии его фотокаталитической активации видимым светом, максимальный эффект проявляется при микробной нагрузке 23 Lg в течение 15-30 мин. в отношении кишечной палочки и 60 минут в отношении золотистого стафилококка при меньшей степени выраженности в условиях агравированной (свыше 3 Lg) нагрузки.
4. Доказанный фотокаталитический эффект антибактериального воздействия образцов НСМ на основе диоксида титана TiO 2 , в частности на медной сетке, позволил рекомендовать данный образец для использования при конструировании опытных устройств очистки питьевых и сточных вод, контаминированных микробиотой смешанной таксономической принадлежности, с целью предотвращения распространения бактериальных инфекций с водным путем передачи.
5. Достоверных эффектов опытных образцов НСМ в отношении химического органического загрязнения по показателю «перманганатная окисляемость» как в условиях с фотоактивацией так и без, а также интегральной токсичности питьевой воды после обработки НСМ в модельных условияхне выявлено.
6. Выявленные эффекты синергического и антагонистического воздействия нанопластин и видимого света требуют дальнейшего, более детального изучения.

Литература:
1. Removal of contaminants of concern in water using advanced oxidation techniques / H.M Coleman [et al.] // Water Sci Technol. 2007. Vol. 55(12). P. 3016.
2. Recent developments in photocatalytic water treatment technology: a review / M.N. Chong [et al.] // Water Research. 2010. Vol. 44, Issue 10. P. 2997-3027.
3. Antimicrobial nanomaterials for water disinfection and microbial control: Potential applications and implications/ Qilin Li. [et al.] // Water research. 2008. Vol. 42, №18. P.4591-4602.
4. Akhavan, O. Lasting antibacterial activities of AgTiO2/Ag/a TiO2 nanocomposite thin film photocatalysts under solar light irradiation /О. Akhavan // J. Colloid Interface Sci. 2009. №336. P. 117-124.
5. Fujishima, A. Titanium dioxide photocatalysis // A.Fujishima, T.N. Rao, D.A. Truk //J.Photochem. Photobiol. C: Photochem. Rev. 2000. № 1. P. 1-21.
6. Результаты экспериментальных исследований по изучению эффективности опыnных образцов наноструктурированных материалов на основе диоксида титана в отношении микробного и химического загрязнения воды / Е.В. Дроздова [et al.] // Здоровье и окружающая среда: сб. науч. тр. / Респ. науч. практ. центр гигиены; гл. ред. С.И. Сычик. Минск, 2013. Вып. 22. С. 39-42.
7. Дудчик, Н.В. Фотокаталитическая инактивация популяций Escherihia coli и Staphylococcus aureus под воздействием структурированных наноматериалов на основе диоксида титана / Н.В. Дудчик, С.И. Сычик, Е.В.Дроздова // Проблемы разработки и использования нанотехнологий в современной профлактической медицине: сб. науч. ст. 9-ой Евразийской науч. конфер. «Донозология 2013»; под ред. М.П.Захарченко. Спб., 2013. C. 3-8. СТБ ИСО 8467 2009 «Качество воды. Определение перманганатной окисляемости».
9. Дроздова, Е.В. C. vidua как тест-модель для оценки токсичности химических веществ, их смесей и объектов окружающей среды / Е.В. Дроздова // Гигиена и санитария. 2012. № 6. С. 78-81.
10. ИСО 6341:1996 Качество воды. Определение иммобилизации Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea). Оценка острой токсичности.
11. ИСО 8692:2004 Качество воды. Испытание на подавление роста пресноводных водорослей с применением одноклеточных зеленых водорослей.
12. Инструкция по применению № 0211112 «Оценка интегральной токсичности объектов окружающей среды методами биотестирования», утв. МЗ РБ 12.12.2012.

Журнал «Вода Magazine», №11 (87), 2014 г.